军团菌及其检测方法

一、军团菌
- n0 p6 U% F7 m7 X1 C       军团菌也称为“退伍军人杆菌”（Legionella spp.），系需氧革兰氏阴性杆菌。目前已确认军团菌属有50个种，供70个血清型。其中最常见病原体为嗜肺军团菌，占病例的85%~90%；其次是米克戴德军团菌（L.micdadei），占病例的5%~10%；再次是博茨曼军团菌（L.bozemanii）和杜莫夫军团菌（L.dumoffii）。
二、军团菌检测方法
1.        细菌培养法
军团菌在分类学上是一种独特的需氧革兰氏阴性杆菌，无荚膜，在普通培养基上不生长，属于细胞内寄生菌。目前标准培养基为活性碳酵母浸膏琼脂平板，也称军团菌生长平板(BCYE)。接种在 BCYE 平板上的样品在温度为35-37ºC，培养10天，在浓度为2.5% CO2 的环境下培养更有利于军团菌的生长。军团菌的菌落通常呈白色、灰色、有荧光。军团菌在 BCYE 平板上生长而在平板和半光氨酸缺失 BCYE-Cys 平板上不生长。
2.        血清学玻片凝集法
现已发现嗜肺军团菌有15个血清型。其中，嗜肺军团菌血清1型（Lp1）与人类疾病关系最密切，其次为血清4型（Lp4）和6型（Lp6）。
关于血清凝集法用的诊断血清方面，推荐天津生物芯片公司生产的嗜肺军团菌全套诊断血清产品。这套产品除了包含嗜肺军团菌1-15型的全部15个血清型的诊断血清以外，还包含了军团菌属6个常见非嗜肺菌种的诊断血清。
检测方法（以下列举天津生物芯片的军团菌诊断血清的操作方法）：
产品在使用前最好恢复温度到室温。
将可疑菌落转接到BCYE生长平板中培养。在洁净玻片上用接种环滴加两滴彼此分离的生理盐水。
: M5 d0 [( X0 ?- \用接种环挑取1环用BCYE生长平板中培养2-3天的可疑菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀。
4 J+ }6 I+ j0 _6 D# C用接种环滴加1～2滴血清于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入一滴生理盐水作为对照。（此步为推荐使用，可以避免自凝）
" @# N( ~7 {4 ?  R) ^用接种环分别混匀玻片上的两种混合液。
轻轻摇动玻片1分钟，观察。于1分钟内呈2+及以上凝集现象为阳性，1分钟内呈现2+以下凝集现象为阴性。
凝集结果判断标准如下：
. \9 g7 h$ a2 x6 p8 F. v
反应强度        判别依据
$ w! z, y/ l4 x( L* X$ j$ H4+        反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大
3+        反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小
2+        反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集
* b; L$ x- m; y( s1 \$ W: W1+        反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
-        反应完全混浊，未出现任何凝集
3.        核酸扩增法
( m2 P$ J5 i+ a, K( N      核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。
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1）        常规PCR：鉴定标准是通过电泳来判断是否有扩增的核酸片段以及扩增产物的大小是否正确。
) @5 A5 D9 y2 G0 ?  t2 G2）        实时荧光PCR：通过对实时荧光PCR反应的每一个循环产物进行荧光信号的实时监测来判断分析。