幼儿园集体食物中毒，致病祸首是“金黄色葡萄球菌”

* \  b2 W, u8 u* U5 R        2014年11月，从中新天津生态城管委会获悉，“艾毅幼儿园49名幼儿集体就医”一事有了新进展，检验报告已经出炉，确诊这些幼儿的致病原因是“食物中毒”，致病祸首是“金黄色葡萄球菌”。检疫人员称，在幼儿园食堂的刀具和切菜案板上，检测到该种致病菌。
据中新生态城管委会社会局相关负责人介绍，事发后，滨海新区卫生局的疾控人员先后多次到艾毅幼儿园的食堂进行取样、检查，进行科学、审慎的检测，并出具报告。“我们还没有拿到最终的报告书，但已经接到口头通知，在刀具和切菜案板上，检测出金黄色葡萄球菌。现在分析，是食堂清洁不到位导致。疾控人员在留样的菜品和食材上，均没有发现该病菌。”该负责人称，金黄色葡萄球菌的发病症状，就是引发腹泻、发烧、呕吐等，该病菌是食物中毒的常见菌。
     金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种普遍存在于自然界中的人兽共患病菌。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是个世界性卫生问题，近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%。中国每年发生此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌作为一种重要的食源性致病菌，它对食品加工业及人们健康存在着潜在的危害。
     随着分子生物学的快速发展, PCR 法成为检测金黄色葡萄球菌的最常用的方法之一。近年来发展起来的分子生物学方法如PCR、多重PCR 、实时荧光PCR等广泛应用于食源性致病菌的检测,克服了传统检测方法的不足。该方法用于金黄色葡萄球菌检测具有特异性强、敏感、快速的特点。
      核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。
1 N: F  ^1 V% H. h; K' |" \检测步骤
1 样品制备、增菌培养和分离
按照传统的标准方法进行，如GB/T 4789.9，SN 0175等。
2 细菌模板DNA的制备
$ k$ N! x5 C# N$ z# t1 Q2.1 增菌液模板DNA的制备
对于上述传统方法培养的增菌液，可直接取该增菌液1 mL加到1.5 mL无菌离心管中, 8000r/ min 离心5min，尽量吸弃上清；加入50μL水或加入50μL DNA提取液（见附录A），混匀后沸水浴5min，12000 r/ min离心5min，取上清保存于-20℃备用以待检测。-70℃可长期保存。
2.2 可疑菌落模板DNA的制备
* k5 {8 f" `6 s/ @对于1方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50μL DNA提取液，再按照2.1步骤制备模板DNA以待检测。推荐试剂：天津生物芯片  空肠弯曲杆菌核酸扩增（PCR）检测试剂盒。
3 PCR扩增
3.1 引物
4 _2 D9 ]* ?5 c/ }0 V3.2 阴性对照、阳性对照设置
* W$ g: S) B7 _) k9 A& H3.3 PCR反应体系
3.4 PCR反应参数
95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸5min。4℃保存。
注：PCR反应参数可根据基因的扩增仪型号的不同进行适当的调整。
3.5 PCR扩增产物的电泳检测
$ J0 Y6 L! N/ z8 j  ?6 U用电泳缓冲液(1×TAE)制备1.8％～2％琼脂糖凝胶(55～60℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL，也可在电泳后进行染色)。取8～15μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
4结果判定和报告
在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现358bp大小的扩增条带，则可报告该样品检验结果为阴性可以出具未检出空肠弯曲菌的报告；如待测样品出现358bp大小扩增条带则可判定该样品结果为假定阳性，则回到传统的检测步骤，进一步应按传统的空肠弯曲菌标准检测方法进行确认，最终结果以传统的方法结果为准。
如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。
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