将细菌全基因组测序和社会网络分析结合---预防疾病暴发新方法

本报讯  据美国科学促进会网站近日报道，在新奥尔良召开的美国微生物学会第111届全体会议上，来自加拿大英属哥伦比亚省疾病控制中心的研究人员，提出了一种将细菌全基因组测序技术和社会关系网络分析相结合的方法，能使公共卫生部门获得更多有关疾病传播的资料，更好地跟踪并防止疾病暴发。
　　英属哥伦比亚疾病控制中心的珍妮弗·加迪和同事运用这种新技术，已成功跟踪调查并最终预防了一次肺结核的暴发。她表示，基因组测序与现有临床和流行病学的详细数据相结合，能模拟构建出疾病的暴发，真实理解病菌在人群中的传播。   
　　在英属哥伦比亚的一个中型社区，几乎每3年就要暴发一次肺结核。10年来，将社会网络分析用于跟踪传染病已经越来越普遍，社会网络分析有点类似于Facebook（脸谱）社交网络，采用了传统流行病学步步深入的做法，不仅仅询问病人曾跟谁联系过，还要询问更多有关时间方面的细节，还有他们去过哪里以及做了什么等等。但仅靠社会网络分析来寻找疾病源头和其他影响因素，结果也很不明确。
　　他们将细菌全基因组测序和社会网络分析结合在一起，得到了更清楚的疾病暴发图景。“病原体的完整基因组测序就是最终的DNA（脱氧核糖核酸）指纹，而全基因组测序所需的成本、时间在呈指数降低，对大部分或全部细菌单独进行测序，并预测它们的暴发已越来越容易。”加迪说。
　　此外，他们还能将一些关键个体确定为超级传播者，这些人长期携带病原菌，且社交网络广阔。根据这种信息在流行病暴发研究的重要性，公共卫生部门的人员正在设法寻找一些社会公众人物，做一次重点筛查。   
　　“我们用基因组测序和社会网络分析阻止了一场疾病暴发，这是传统方法无法做到的。”加迪说，“对公共卫生署来说，这是流行病学和传染病研究的一个新方向。”
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结核反击战：流行病学与基因组学的共同战役
本文叙述了加拿大一次结核爆发事件的流行病学研究成果。除了传统的流行病研究方法——社会网络调查之外，研究者还利用了分子流行病学的技术——基因组测序方法，找出此次爆发结核杆菌的流行病学特点：很可能是精制可卡因的使用增多触发了两个现存的结核分枝杆菌谱系的同时扩展，而高危社交网络的关键成员则起了维持作用。流行病学与基因组学的结合也预示着未来“分子流行病学”的发展趋势。

结核是当今世界危害最大的“国际犯罪团伙”之一，即使在发达国家，这一犯罪团伙依然在百折不饶地兴风作浪，更有愈演愈烈之势。为了严厉打击这一古老顽固的犯罪团伙，警方——伟大的医务工作者们制定了一系列强硬的作战计划。首先是“游击战术”——对于每一位结核患者予以早期、联用、适量、规律、全程的规范治疗方法，遏止每一位患者的结核病情。此乃下策，战术精华概括为八个字：“兵来将挡，水来土掩”。其次是“防御战术”——接种卡介苗，使人体产生对结核菌的强大免疫力，阻止结核军队的入侵。此乃中策，所谓“高筑墙、广积粮”。最后是“反攻战术”——潜心研究他们的传播网络，从俘虏身上了解团伙特点，试图找到“罪魁祸首”，以长驱直入，进攻老巢。此乃上策，也就是传说中的“知己知彼，百战不殆”。本期的NEJM的《一次结核爆发案例的全基因组测序和社会网络分析》一文就以2006-2008年期间加拿大不列颠哥伦比亚省的一次结核爆发为案例，带大家了解这一“结核反击战”的具体作战策略和最终结局。

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这次战役的主角是2006年5月至2008年12月31日期间与该团体进行过正面交锋的“勇士”——41名结核患者。工欲善事，必先利器，战场武器包括两种：一为流行病学调查；二为基因组测序。
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先说流行病学调查，除了传统的接触-追踪方法外，研究者还使用了社会网络问卷（social-network questionnaire，SNQ）对患者进行社会学调查，通过结构化、开放的访问方式，详细调查患者药物、毒品和酒精使用情况，居住史和旅行史，接触人群情况等等（调查问卷具体内容见原文附录）。那么，这两种方法孰好孰坏呢？原文图2就对比了传统接触追踪方法与SNQ的结果，发现使用传统方法病不能完全确定“根源病例”——那个最先携带结核杆菌的“始作俑者”。但是，通过SNQ，警方很快锁定了一位“犯罪嫌疑人”，编号MT0001的成年肺结核患者，并且调查出了他的数个“犯罪地点”即传播地点，其中就包括一系列的毒品窝点。这也部分解释了为什么61%的SNQ被调查者都表示曾经服用过可卡因。从原文图1的数据来看，警方提供的可卡因相关事件的数目与结核的爆发例数的变化趋势似乎一致。并且发现的毒品窝点数目在结核爆发的高峰期也有所增长。因此，可卡因和结核这两大犯罪团伙很有可能沆瀣一气，互相勾结。宿主免疫的损害、缺乏医疗保健途径、差而拥挤的卫生环境可能是这两大集团犯上作乱的联系纽带。这两种方法的差异也提示我们SNQ等社会网络分析的应用可能能更好地帮助我们“顺藤摸瓜”，及时遏制犯罪源头。

除了用这一传统的方法追踪敌人踪迹外，警方还利用基因组测序技术搜寻敌军的真实面目。这一技术包括传统的IS6110 限制性内切酶片段长度多肽性（restriction fragment length polym- orphism, RFLP）测序方法，以及结核分枝杆菌多位点的数目可变串联重复序列(mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number of tandem repeat, MIRU-VNTR)方法。MIRU-VNTR是近年发展起来的以 PCR为基础的DNA指纹识别技术之一，它的鉴别能力比RFLP更强。以MIRU-VNTR 为基础的分型方法依靠与位点侧翼区互补的寡核苷酸引物对不同位点进行PCR扩增，由扩增产物的长度来决定插入重复单位的拷贝数。生物中的不同个体表现为侧翼区序列具有高度保守性，而串联重复单位的数目不同。结核分支杆菌的 VNTR 的重复次数在不同家族、种型、属水平上存在差异，对某一结核分支杆菌 VNTR 重复次数的绘制和分析就可判断该菌株与标准株存在的遗传进化关系。

测序结果见原文图3。通过对单核苷酸多态性（SNP）的研究，警方意外发现这次的犯罪事件是由两个不同的犯罪团伙导致的，姑且将其称为A队和B队。这两队的基因并不相同，但是他们所犯的罪行却是一样的：双方的受害者在临床表现、结局、危险因素等方面并没有显著差异(见原文表1)。并且，他们并非完全独立，大部分的受害者与二者都有过接触。警方随即搜寻了这两队的“犯罪记录”，发现他们都是当地“惯犯”，在2006年之前的结核菌种中能找到与A、B极其类似的菌种，并且他们可能都是由2001年的某位祖先进化而来的。因此，很有可能是06年之前的某个社会环境因素如上文提到的可卡因使用导致了结核爆发，而并非单独的基因突变所致。另外，使用MIRU-VNTR技术，警方更加确定了MT0001的嫌疑：有13个传播事件与其相关，并且引起了A组6个病例的发生（见原文图4A）。除此之外，警方还发现了B组的两个源头病例——MT0010和MT0011。这三位嫌疑人的结核菌涂片均为阳性结果，并且在治疗开始的几个月前就已经出现了症状。可见在分析源头方面，基因测序方法比前面提到的社会网络分析还要准确。

总结这场结核反击战，流行病学的武器相当于“坦克大炮”，可以通过火力强攻，大面积摧毁战场，找到犯罪同盟（如本文所说的可卡因），得到粗略的爆发研究结果；而基因学武器则是把“黄金手枪”，能够更加精细地找出敌人的差异及特点，个个击破。也许全基因组测序并不能在当今成为结核爆发事件的常规调查手段，但是它却能提供最准确灵通的结核杆菌基因突变的信息，同时也促进了高分辨率基因分型方法的发展。相信在未来，随着这一技术的普及，“坦克大炮加黄金手枪”的组合必然会在结核反击战中大放异彩，所向披靡！
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来源：Whole-Genome Sequencing and Social-Network Analysis of a Tuberculosis Outbreak，Jennifer L. Gardy, Ph.D.等人, N Engl J Med 2011; 364:730-739，February 24, 2011

% J1 G- l2 U$ h3 b3 a) K参考：多位点数目可变串联重复序列在结核分枝杆菌分子流行病学中的应用进展，米利古等人，现代生物医学进展，2009 Vol9 No8

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This is a very interesting paper...... I downloaded but had not read it yet :(